Préparer des échantillons de diatomée (partie 2)

Lisez la partie 1, dans laquelle Joe Holmes nous introduit aux diatomées : ce que sont ces organismes microscopiques et leur importance.

Au début 2013, j’ai commencé comme bénévole au labo de phycologie du Musée canadien de la nature, à Gatineau au Québec. À mon arrivée, j’ai appris à préparer les spécimens de diatomée pour l’entreposage et l’étude au microscope.

Un assortiment de diatomées.

Plusieurs espèces de diatomées vues au microscope électronique. Image : Paul Hamilton © Musée canadien de la nature

En raison des étapes nombreuses et longues, le traitement d’un seul échantillon peut requérir deux jours, en partant du spécimen sec recueilli sur le terrain pour terminer avec une lame prête à être glissée sous le microscope. Comme il y a normalement des dizaines d’échantillons à traiter, on procède en groupe de 12. Pour traiter une boîte de 100 échantillons ou plus, il faut une semaine à temps plein, ou quelques mois à temps partiel (c’est mon rythme à une journée de travail par semaine).

Nettoyage des valves à l’acide

La première chose à faire quand on reçoit un échantillon, c’est de nettoyer les microscopiques coquilles (valves) des diatomées de tout matériel organique, un peu comme on le ferait avec un coquillage ramassé sur la plage.

À partir d’un flacon d’échantillon (sec ou humide), on prélève du matériel contenant des centaines ou des millions de diatomées et on le met dans un bécher de verre. On inscrit sur celui-ci le numéro de référence de collection de l’échantillon. On gratte le papier filtre du matériel poudreux provenant des flacons à échantillons. On traite normalement les échantillons en groupe de 12.

Béchers et flacons sur un comptoir.

Béchers contenant des matières sèches provenant des flacons à échantillons. Image : Joe Holmes © Musée canadien de la nature

On ajoute dans chaque bécher une petite quantité d’un mélange acide et on fait bouillir sur une plaque chauffante de 25 à 30 minutes à haute température. On laisse ensuite refroidir le récipient pendant 15 ou 20 minutes avant le passage à la centrifugeuse. L’ébullition dans l’acide a un effet de dissolution et sert à séparer les diatomées des autres matières organiques et de laisser leurs coquilles de silice parfaitement propres. Le reste des particules ressemble à de petits cailloux et à de l’argile.

Équipement sous une hotte de laboratoire.

Flacon verseur pour l’acide et béchers en train de bouillir sur une plaque chauffante. Image : Joe Holmes © Musée canadien de la nature

Centrifuger le mélange d’eau

Pour séparer les diatomées des autres matériaux, on a recours à une série de dilutions avec de l’eau désionisée, c’est-à-dire débarrassée de presque toutes ses impuretés minérales.

Après ébullition, on vide chaque bécher dans un tube à centrifuger en plastique, sur lequel on inscrit le numéro de référence de l’échantillon. On remplit ensuite le tube d’eau désionisée jusqu’à un centimètre du bord.

On place les tubes dans la centrifugeuse que l’on fait tourner à 3000 tours par minute pendant 10 minutes. Le but de cette opération est de forcer les diatomées à tomber au fond du tube en forme de cône.

Un coup d'oeil dans la centrifugeuse.

La centrifugeuse avec 12 tubes prête à fonctionner. Image : Joe Holmes © Musée canadien de la nature

Ensuite, on retire presque tout le liquide à l’aide d’un petit tuyau fixé à une pompe aspirante. On obtient les diatomées dans le fond avec un peu de liquide.

On remplit de nouveau les tubes avec de l’eau désionisée et on répète les mêmes opérations (centrifuger, pomper, remplir) cinq fois en vue de purifier le mélange de diatomées.

Après le dernier pompage, les diatomées et l’eau sont mélangées et versées dans un nouveau flacon à échantillons. On se sert souvent d’un grattoir en métal pour retirer tout le matériel qui colle au fond. On consigne sur le bouchon le numéro de référence de l’échantillon.

Chaque flacon de l’échantillon final doit être rempli au quart avec le mélange diatomées et eau. On range les flacons dans une boîte qui en contient 100 et on place la boîte dans un tiroir de l’armoire de la collection humide en attendant de préparer des lames de microscope.

Ces opérations exigent des mesures de protection. Je porte des gants de caoutchouc néoprène et une visière pour protéger mon visage quand je manipule des acides. L’ébullition de l’acide se déroule sous une hotte qui aspire les vapeurs toxiques. Pour centrifuger et pomper, je mets des gants de latex. L’eau résiduelle est évacuée de façon écologique.

Un homme portant un équipement protecteur dans un laboratoire.

Joe Holmes travaillant à la hotte de laboratoire. Image : Paul Hamilton © Musée canadien de la nature

Préparer les lames pour microscope optique

Le microscope optique peut grossir un objet jusqu’à 1600 fois et permet d’examiner les couches de diatomées grâce à sa focalisation micrométrique.

Pour réaliser des lames de verre d’échantillon de diatomées destinées à l’observation au microscope, on utilise des échantillons humides de la collection du Musée. On installe une platine chauffante pour lames avec des couvre-objets vierges en verre correspondant aux flacons à échantillons à traiter. On met une goutte d’eau désionisée sur chaque porte-objet à l’aide d’une micropipette.

On agite doucement chaque flacon pour bien mélanger les diatomées avec l’eau, puis on ajoute deux ou trois gouttes de l’échantillon sur le porte-objet correspondant. On nettoie la micropipette avec de l’eau désionisée entre chaque échantillon pour éviter une contamination croisée.

On laisse sécher les porte-objets jusqu’à ce qu’on obtienne une boue de diatomées séchées sur chacun.

On prépare une lame vierge pour chaque porte-objet en inscrivant sur la portion étiquette de la lame le numéro de référence de l’échantillon (avec une plume, une étiquette autocollante ou un instrument à graver).

Ensuite, il faut coller de façon permanente le porte-objet sur la lamelle de verre correspondante. Pour ce faire, on utilise un scellant (au Musée du Naphrax ou du Hyrax) qui a la couleur et la consistance du miel.

Un moment donné, on chauffe chaque lame sur une plaque chauffante à 300 °C pendant trois ou quatre secondes. On ajoute une goutte de scellant à la lame grâce à une baguette de verre. On place avec des pinces le porte-objet correspondant (avec la face propre vers le haut) sur le scellant qui fait des bulles. Avec un petit outil métallique, on expulse les bulles d’air du porte-objet afin qu’il adhère parfaitement à la lame.

On laisse le tout refroidir au moins 15 minutes. On enlève l’excédent de scellant avec une lame de rasoir puis on nettoie avec un chiffon humide.

Les lames sont alors prêtes à l’emploi sous le microscope. Elles sont rangées par numéro de référence dans un tiroir de métal contenant 20 lames des armoires de bois de la collection du Musée.

Une armoire ouverte avec un tiroir tiré.

Une armoire destinée aux lames porte-objets. Image : Joe Holmes © Musée canadien de la nature

Préparer les disques pour microscope électronique

On se sert d’un microscope électronique à balayage pour examiner certains détails précis au sein d’une diatomée. Cet appareil a un pouvoir de grossissement allant à 100 000 fois, mais en général un grossissement de 20 000 suffit pour l’observation des diatomées.

On utilise une méthode différente pour préparer les échantillons à une analyse au microscope électronique. On fait sécher l’échantillon humide sur un morceau de papier d’aluminium que l’on place sur un disque métallique, plutôt que sur un porte-objet.

On procède ensuite à d’autres opérations faisant appel à un procédé à vide pour appliquer une fine couche d’or qui servira de conducteur avant utilisation du disque.

Parce qu’on se sert d’or et d’équipement coûteux, l’emploi d’un microscope électronique revient plus cher que celui d’un microscope optique (que le Musée possède en grand nombre).

Entreposage des données

Avec les deux types de microscopes, nous avons des logiciels et des appareils spéciaux capables de prendre des photographies de diatomées.

Les photos et les données concernant les spécimens sont versées dans la base de données de la collection de phycologie du Musée, qui est accessible en ligne à tous.

Texte traduit de l’anglais.

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